技術文章

當前位置：首頁技術文章厭氧菌的分離、培養及鑒定

厭氧菌的分離、培養及鑒定

更新時間：2014-01-17

點擊次數：7760

一摘要：

1．1 實(shí)驗(yàn)内容：

厭氧菌的分離(lí)、培養及鑒(jiàn)定；

1．2 目的：

1 掌握厭氧菌的分離(lí)、培養及活菌計(jì)數的一般方法。

瞭(le)解厭氧菌菌鑒(jiàn)定的一般方法。

2 複(fù)習並(bìng)鞏固平時所學的微生物知識與技能。

3 培養獨(dú)立思考、設計和動(dòng)手實驗的能力。

二介紹：

厭氧微生物在自然界分布廣(guǎng)泛，種類(lèi)繁多，其生理作用日益受到人們的重視。

專性厭氧菌，對(duì)氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電(diàn)勢的培養環境。

厭(yàn)氧菌的培養(yǎng)：

在培養厭氧菌時，zui需要控制的是厭氧條件，在pH=7.0,O2的濃度與1atm的氧平衡時，O2——O2-反應的電位是0.81V，因此，在-0.33V時，O2濃度是大氣壓中O2濃度的10-75。每升飽(bǎo)和瞭(le)空氣的水中含有1.48×10-55個O2。所以說，要保證厭氧菌培養時的低電位是很重要的。

厭氧菌的培養方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術，亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特於(yú)1950年提出並(bìng)應用於(yú)瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術因此他是世界上*個分離純化厭氧菌的人。

以後這項技術又經曆瞭(le)幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善，並(bìng)逐漸發展成爲研究厭氧微生物的一套完整技術，而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極爲有效的技術。該技術的優點是：預還原培養基制好後，可随時取用進行試驗；任何時間觀察或檢查試管内的菌種都不會幹擾厭氧條件。

三實驗材料與設(shè)備(bèi)：

3．1 分離(lí)與培養(yǎng)：

3．1．1菌種：待測(cè)樣(yàng)品；

3．1．2 培養(yǎng)基：改良的PRAS培養(yǎng)基(氮素自加）

[配方組成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸鈉5g,乙酸鈉5g,甲醇3.5ml,Ph值爲7.0,蒸餾水1000ml,1%的樹脂刃天青（還(hái)原指示劑(jì)）1ml,121攝氏度滅菌20min.使用前每5ml培養基加入1%Na2S（還(hái)原劑(jì)）和5%NaHCO3及3000u/ml青黴素液（抑制劑(jì)）各0.1ml]

3．1．3 試劑(jì)：冰塊(kuài) Na2S NaHCO3

3．1．4 器材：高純(chún)氮氣厭氧管厭氧手套箱注射器恒溫培養箱銅柱除氧系統定量加樣器厭氧罐超聲波破碎儀酒精燈冰塊水浴鍋記号筆(bǐ) 振蕩器等

3．2 菌種(zhǒng)的鑒(jiàn)定：

3．2．1 菌種(zhǒng)：待測(cè)菌

3．2．2 培養基；糖發(fā)酵培養基、蛋白胨水培養基、澱(diàn)粉培養基（液體）；

3．2．3 試劑(jì)；乙醚吲哚試劑(jì) 盧(lú)戈氏碘液；

3．2．4 器材：超淨工作台恒溫培養箱高壓蒸汽滅菌鍋(guō) 接種環(huán) 移液管載玻片顯微鏡等

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟：

4．1分離(lí)與培養(yǎng)

4．1．1 銅(tóng)柱系統(tǒng)除氧

銅柱是一個内部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管。此管的大小爲40～400mm，兩端被加工成漏鬥狀，外壁繞有加熱帶，並(bìng)與變壓器相連來控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由於從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2 和H2等都含有微量O2，故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變爲黑色。當向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的氧就結合形成H2O，而CuO又被還原成瞭(le)銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反複的使用，並(bìng)不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發生器産生。

4．1．2 預還(hái)原培養基及稀釋液的制備(bèi)

在無氧無菌的超淨厭氧手套箱中的條件下，制作預還原培養基及稀釋液時，先将配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而後用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，並(bìng)插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚的看到培養基内加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅zui後變成無色，說明試管内已成爲無氧狀态，然後蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，於(yú)滅氧罐中滅菌備用。

4．1．3 分離(lí)

（1）編号

取五支無菌水試管，分别用記(jì)号筆(bǐ)标明10-1、10-2……10-5。

（2）稀釋

在無氧無菌的超淨厭氧手套箱中的條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩(dàng)器将其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進行10倍系列稀釋，至10-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度進行滾管計數。

（3）滾(gǔn)管分離(lí)

1）滾管

将無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當培養基從瓶中取出時，要用N2在培養基内中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管内空氣，然後把培養基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及時拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0 .1mL，分别注入待用的試管中，然後将其平放於(yú)盛有冰水的瓷盤中迅速滾動，帶菌的溶化瓊脂在試管内壁會即刻形成凝固層(céng)。

2）分離純化

生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形态及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，並(bìng)再次挑取菌落，直至獲得純培養物爲止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定，做好标記。然後将培養基試管固定於(yú)适當的支架上，打開試管膠塞，同時迅速将氣流适當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管内。同時，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。将準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基内，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管内，加塞。37℃培養，培養24h或更長時間或待培養液混濁後檢查已分離培養物的純度。

3）劃線分離

将試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著(zhe)打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線後的卷管直立保溫，使用CO2:H2=80:20,因爲CO2比空氣重，開啓後管塞不緻有空氣殘(cán)留。劃線後的滾管，置34-37度下培養，便可長出菌落。

4．1．4 鏡檢(jiǎn)與計(jì)數

（1）鏡檢

挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色後(hòu)鏡檢，觀(guān)察菌體形态。

（2）計數

液體純(chún)培養物經系列稀釋後，按上述滾管法培養。然後對(duì)固體滾管計數，計算每克或每毫升樣品中含有厭氧菌數量cfu/g（mL）樣品=A×10ml×X/10×D

A-0.1mL滾(gǔn)管計(jì)數的實際平均值；

X- 鏡(jìng)檢(jiǎn)呈現爲厭氧菌的數目；

X/10-菌落中厭(yàn)氧菌的概率；

D- 稀釋(shì)倍數(shù)

4．2 菌種(zhǒng)的鑒(jiàn)定

4．2．1糖發(fā)酵試(shì)驗

糖發酵實驗是zui常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤爲重要。絕大多數細菌都能利用糖類作爲碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖並(bìng)産酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌隻産酸不産氣。例如大腸杆菌能分解乳糖和葡萄糖産酸並(bìng)産氣；傷寒杆菌能分解葡萄糖産酸不産氣，不能分解乳糖；普通變(biàn)形杆菌分解葡萄糖産酸産氣，不能分解乳糖。酸的産生可以利用指示劑來斷定。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8（紫色）]，當發酵産酸時，可使培養基由紫色變(biàn)爲黃色。氣體的産生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。

具體(tǐ)實(shí)驗步驟：

① 将菌液進行适當(dāng)稀釋，之後(hòu)在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

② 将接種後(hòu)的鑒(jiàn)定管放入厭氧罐中，充足氮氣後(hòu)放入37℃恒溫培養箱培養。

③ 24h後觀察各管中液體顔色變(biàn)化及産(chǎn)氣情況。

4．2．2 蛋白質分解實(shí)驗(yàn)

① 将菌液進行适當(dāng)稀釋，之後(hòu)在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

② 将接種後(hòu)的鑒(jiàn)定管放入厭氧罐中，充足氮氣後(hòu)放入37℃恒溫培養箱培養。

③24h後(hòu)各管分别進行米倫氏反應、吲哚反應、黃(huáng)色反應和坂口反應等。

4．2．3 澱(diàn)粉水解實(shí)驗

① 将菌液進行适當(dāng)稀釋，之後(hòu)在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

② 将接種後(hòu)的鑒(jiàn)定管放入厭氧罐中，充足氮氣後(hòu)放入37℃恒溫培養箱培養。

③ 24h後於(yú)各管中加入适量盧戈氏碘液觀察澱(diàn)粉的水解情況。

五注意事項(xiàng)及注釋(shì)：

1 注射器在使用前必須經(jīng)過(guò)121℃、20min滅菌。

2 注意無菌操作，保持手和培養管的清潔(jié)。每次接種前需用酒精棉球将厭氧管蓋(gài)子擦一遍。

3 用注射器吸取菌懸液注入固體(tǐ)培養基後(hòu)，如需再次吸取，應快速将注射器插入厭氧管中，以防止針頭污染。

4樹脂刃天青（resazurin）既是還原劑又是指示劑，它可以把培養基中殘(cán)留的溶解氧去除，其氧化還原電(diàn)位指示敏感範圍爲-42mV。有氧時呈紫色或粉紅色，無氧時呈無色（培養基的顔色），它是較爲理想的氧化還原電(diàn)位指示劑和培養嚴格厭氧菌*的。

5培養基中加入的青黴素是用來(lái)抑制其它細菌生長(zhǎng)的，因爲厭氧菌的細胞壁成分爲假肽聚糖，不受青黴素影響。

6注射器在使用前必須先用培養基上面的氣體沖洗、填充，然後插入培養基的下層(céng)，以保證當培養基移入試管時，就處於(yú)無氧氣體層(céng)的下面。

上一條如何實現藥品穩定性試驗箱等機械設備的全面清理
下一條幾類培養箱的維護要點